胰腺导管腺癌治疗新思路，了解一下

近期，纽约大学医学院和冷泉港实验室共同发表了关于胰腺导管腺癌（PDA）发展中程序性坏死诱导的 CXCL1 和 Mincle 信号通路作用机制的科研成果，文章中阐明了 PDA 中程序性坏死诱导的 CXCL1 和 Mincle信号通路平行作用机制网，并且这种信号通路能够决定性的促进巨噬细胞诱导的自适应免疫抑制作用，作者提出每一种信号通路机制都可能代表了实验性治疗的新方向。

引言

细胞凋亡是一种伴随 caspase 蛋白酶激活的细胞死亡方式 ^[1]。不同于细胞凋亡，程序性坏死（necroptosis）作为一种 caspase 非依赖性的程序性细胞死亡方式，可以由 TNF-α 死亡配体、干扰素、Toll 样受体（TLRs）相关配体以及 DAI 引起的病毒感染所触发 ^[2]。RIP3 和 MLKL（混合系列蛋白激酶样结构域）是细胞程序性坏死的关键分子 ^[3, 4]。程序性坏死具有与坏死相似的细胞形态学改变，并且主要受到受体相互作用蛋白激酶 1（RIP1）和蛋白激酶 3（RIP3）调控。当诱导程序性坏死时，被激活的 RIP1 通过 RIP 同型作用基团与其下游信号因子 RIP3 相互作用形成一种称为 「坏死体」（necrosome）的蛋白复合体 ^[5]。
 

TNFR1 介导的 necroptosis 信号通路示意图

数据来源：Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion

胰腺上皮肿瘤细胞被广泛认为会死于 Caspase 8 依赖的细胞凋亡，并且化疗被认为会进一步促进肿瘤细胞的死亡。细胞凋亡程序的破坏是癌细胞生存的基本方式。然而，程序性坏死，或程序性细胞坏死的作用，在 PDA 中并不确定。在 PDA 中有大量潜在的程序性坏死的诱导因素，包括 TNFR1、CD95、TRAIL receptors、Toll-like receptors、ROS 以及化疗。作者报道了细胞坏死体的主要组分 RIP1 和 RIP3，RIP1 和RIP3 在 PDA 中大量表达，并且在化疗后的表达水平更高。在体外阻断坏死体会促进癌细胞增殖并且诱发恶性肿瘤显型。与之相比，在体内 RIP3 缺失或抑制 RIP1 可以抑制癌症发展，并与高免疫原性的髓细胞和 T细胞浸润的发展有关。

免疫抑制肿瘤微环境 (TME) 与完整的 RIP1 / RIP3 信号通路有关，在某种程度上取决于程序性坏死诱导的 CXCL1 表达，封闭 CXCL1 可以抑制 PDA。此外，作者发现在 PDA 中细胞质 SAP130 通过 RIP1/RIP3 依赖方式表达，细胞质 SAP130 的同源受体巨噬细胞诱导的 C 型凝集素 (Mincle) 在肿瘤浸润骨髓细胞中含量升高。Mincle 通过 SAP130 促进肿瘤形成，然而 Mincle 缺失可以避免此现象发生，并且表现为 RIP3 缺失中TME 的免疫原性重组。细胞耗竭试验表明抑制巨噬细胞可以促进 PDA 中的肿瘤形成，在 RIP3 或 Mincle 缺失的情况下巨噬细胞失去了免疫抑制效果。在 RIP3 或 Mincle 缺失条件下，抗肿瘤免疫反应中完整的 RIP3或 Mincle 信号通路重组成为必要的介质，T 细胞对于宿主中 PDA 的发展并非是必须的。作者阐述了决定性的促进巨噬细胞诱导的自适应免疫抑制 PDA 发展的程序性坏死诱导的 CXCL1 和 Mincle 信号通路平行作用机制网，并且提出每一个信号通路机制都代表了实验性治疗的新目标。

在研究中作者首先通过 Western Blot 实验证明了 RIP1 和 RIP3 在人的 PDA 中比周围正常的胰腺组织中的表达量更高 (Fig. 1a, b, c)。免疫荧光实验结果表明 RIP1–RIP3 共同定位在人 (Fig. 1d) 和小鼠 (Fig. 1e) 的 PDA中，并且显示坏死体的结构复杂。坏死体中各个组分的表达在人的 PDA 细胞中可以被化疗诱导，而抑制 MLKL 可阻止化疗导致的细胞死亡 (Fig. 1j, k)。

程序性坏死是一种促炎症反应的过程，作者证明了在 PDA 中坏死体依赖于 CXCL1 的调控。RIP3 的缺失可以促进 PDA 中淋巴细胞浸润并且能够诱导免疫抑制骨髓细胞的浸润。在人的 PDA 中高水平的 RIP1/RIP3共表达与骨髓细胞标志物 CD11b 表达量升高相关 (Extended-Data-Fig. 2i)。在上皮隔室中封闭 RIP3 可以单独抑制 PDA 的发展，在上皮外隔室中阻断程序性坏死同样可以单独抑制 PDA 发展。

在 PDA 中 CXCL1 的表达取决于坏死体 (Fig. 2)，而单独的 CXCL1 过量表达因素并不能解释整个免疫抑制的表现型与 PDA 中完整的程序性坏死信号通路之间的关系。Mincle 是一种 C 型凝集素受体，能够通过死细胞中释放出来的核蛋白 SAP130 促进体外的无菌炎症反应。作者发现 SAP130 在人的 PDA 细胞质中高度表达 (Extended-Data-Fig. 5a)。SAP130 的表达量也可以通过化疗处理人 PDA 细胞被上调 (Extended-Data-Fig. 5b)。在 PDA 中 SAP130 的表达在上皮细胞和炎症细胞中都很明显 (Extended-Data-Fig. 5e, f)。共聚焦显微镜数据表明 SAP130 与 RIP1/RIP3 共定位在人 (Extended-Data-Fig. 5g) 和小鼠 PDA 中。免疫荧光实验确定了Mincle 在富含 PDA 浸润的白细胞中表达 (Extended-Data-Fig. 6e)。Western blotting 实验显示在 PDA 中通过RIP3 依赖的方式 Mincle 相关的信号传导的表达量升高 (Extended-Data-Fig. 6g)。而在 PDA 中 Mincle 缺失不能降低 CXCL1 的表达量，并且阻断 CXCL1 没有改变 Mincle 相关的信号转导的表达量。
 

为了证明 Mincle 信号是否刺激肿瘤形成，作者采用 Mincle ligand TDB 连续处理 6 周龄的 KC 小鼠，实验结果证明了在 PDA 中 Mincle 活化作用对肿瘤发生的影响不是独立的就是受 RIP3 信号下游影响。作者证明了 CXCL1+Mincle 阻断可以增加抑制肿瘤的效果，但 RIP3+Mincle 阻断或 RIP3+CXCL1 阻断与单独的 RIP3 相比没有提供额外的抑制作用 (Extended-Data-Fig. 8f)。

在野生型宿主中 TAMs 促进 PDA 的发展，而 T 细胞对于 PDA 的发展并非是不可或缺的。与此相反，在没有 RIP3 或 Mincle 信号通路的情况下，巨噬细胞屈服于其肿瘤促进作用并且 T 细胞重组为抗肿瘤免疫不可缺少的介质。

作者的研究工作表明 PDA 中程序性坏死诱导的 CXCL1 和 Mincle 信号通路促进骨髓细胞诱导的适应性免疫抑制。并且提出每一个信号通路机制都代表了实验性治疗的新方向。

研究中作者采用了 Bioss 产品 Rabbit Anti-RIPK-1 antibody (bs-5805R)、Rabbit Anti-RIPK3 antibody (bs-3551R) 进行了 IHC 和 IF 实验检测 RIP1 和 RIP3 在 PDA 中的表达情况，并且这两个产品同时在其他作者的文章中被用于 WB 实验。

The expressional level of RIP-1 and RIP-3 increased dramatically in ARH-77 cells after lycorine treatment for 24 h. β-Actin was used as a loading control.
数据来源：Lycorine induces programmed necrosis in the multiple myeloma cell line ARH-77

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参考文献

[1] Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012.

[2] Necroptosis: Pathway diversity and characteristics.

[3] Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.

[4] Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.

[5] The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.