科研大神说，Western Blot是研究僧的劳斯莱斯...

 
 生物届有一句名言——Western Blot是研究僧的劳斯莱斯。

Western Blot（蛋白印迹）虽然是科学研究中最为基础平常的实验，其背景里却蕴含了很多知识，操作过程中也有许多trick，可以说“好的WB结果是顺利毕业的一半”。
 

1.蛋白样品制备——千万别garbage in,garbage out

A: 蛋白提取：裂解要快速彻底，先变性后保存，在不影响后续实验的情况下尽量选择较强的裂解液 (RIPA裂解液)；蛋白提取要在低温条件下进行，防止蛋白自溶或降解，同时可以加入适当的蛋白酶抑制剂以减少蛋白酶的水解作用。磷酸化蛋白提取还需加入蛋白磷酸酶抑制剂，以防止蛋白去磷酸化。

B: 蛋白定量：确定合适的上样量，最常用的为BCA法 (BCA蛋白定量试剂盒)。

2.电泳SDS-PAGE——合适即完美

A: 制备上样样品：根据实验要求，选择变性/非变性上样缓冲液，上样前可以适当离心。

B: 配制聚丙烯酰胺凝胶：根据蛋白分子量的大小选择合适的胶浓度，蛋白分子量小应选择高浓度的胶，蛋白分子量大则选择低浓度的胶；TEMED和APS促进凝胶反应，一般先加TEMED，后加APS；常温下半小时胶可凝固，若天气寒冷或需加快凝固，可将其置于37℃孵箱中加速凝固；胶最好现配现用，如果需要短暂保存，要用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。

C: 配制电泳缓冲液：内槽电泳缓冲液要现配现用。

D: 根据蛋白分子量选择合适的预染Marker。

E: 浓缩胶电压一般采用100V左右，待溴酚蓝迁移出浓缩胶后再换为200V。

3.转膜——小手抖一抖，条带变没有

A: 胶在负极，膜靠近正极；为防止短路，滤纸不要大过膜【“三明治夹心”如图示】，夹好膜和凝胶后，确保凝胶、膜和滤纸之间无气泡，否则会导致转膜不完全。

B: 转膜缓冲液要提前冷却，且胶要在转膜缓冲液里平衡一下，防止胶变形，同时有助于去除影响转膜的杂质；转膜全程带手套操作，避免手印污染影响结果；膜上可以剪一个小角用来标记正反面。

C: 湿转法转膜的电流一般在200-400mA之间，转膜时间为30-60分钟，也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据蛋白的分子量大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，分子量越小则需要的转膜时间越短。

D: 可使用丽春红染色液初步检测转膜效率，它与下游WB检测完全兼容，无任何干扰。染色后可以用蒸馏水，PBS或者其他溶液洗去。可用于PVDF膜、硝酸纤维素膜 (NC膜)和醋酸纤维素膜上蛋白的检测，不适用于尼龙膜上的蛋白检测。

4.免疫印迹——接下来就是见证奇迹的时刻

A: 常见的封闭液有5%脱脂奶粉和BSA封闭液，磷酸化蛋白使用BSA作为封闭液， 脱脂奶粉会对磷酸化蛋白检测有影响。

B: 封闭时间和封闭液剂量要足够，封闭不充分显色背景会过深；洗膜时间要适当，一般用TBST洗涤5min×3次，过度洗膜会使信号减弱；抗体的稀释倍数按照产品说明书和实验要求进行适当调整，抗体浓度不宜过高。

C: 显色：一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法，A、B发光液按比例稀释混合，现配现用。不同蛋白最佳曝光时间不同，如果同一张膜上不同样品信号差异太大，可以尝试将膜剪开再分别进行曝光。

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蛋白免疫印迹(WB)实验流程及配套试剂