WB超级专题月 | WB内参抗体选择指南

3. 目的蛋白定位：

（1）细胞质蛋白：β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、GAPDH、Vinculin、Cyclophilin B等；

（2）细胞核蛋白：PCNA、Lamin A、Lamin B、Histone H3、K70、K80、Erk2、TATA binding protein (TBP)、c-Jun、c-Fos、YY1、HDAC1等；

（3）细胞膜蛋白：Na⁺/K⁺ ATPase等；

（4）细胞质膜蛋白：ATP1A1 (Sodium Potassium ATPase)等；

（5）线粒体蛋白：VDAC1、COXIV等；

（6）全血/血浆/血清：Transferrin、Albumin等。

4. 表达水平：

在特定实验条件下（如特殊的实验处理或不同的发育阶段），内参蛋白的表达水平相对于总蛋白需要保持恒定且高表达。常用的内参是由管家基因表达的，是细胞发育和维持细胞活力所必须的蛋白。例如，细胞核的内参蛋白PCNA，在DNA S期表达，因此对于非增殖细胞不推荐使用。

5. 丰度相似性：

实验样本中内参蛋白的表达丰度应与目的蛋白的丰度有相似性，实验方案和检测方法可以揭示内参蛋白和目标蛋白水平的变化，而不会出现信号饱和。如果内参蛋白的表达水平远远高于目的蛋白，必须对内参蛋白进行梯度稀释以确定内参蛋白的检测范围。

6. 表达因素：

（1）选择蛋白表达不受实验变量影响的内参，有研究表明，管家蛋白的表达有时并不恒定，会因实验条件的改变而改变。因此设计实验方案时应该考虑实际的实验因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意内参表达是否出现异常。

（2）在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性。

（3）在某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。

（4）涉及细胞增殖的相关实验中，c-Jun由于自身表达变化不适合做内参。

（5）在做凋亡实验时，TBP、Lamin等不适合作为内参。

（6）做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，应选择结构蛋白作为内参，如β-Actin和β-Tubulin。

（7）做各种分泌液样本的时候，如血浆、乳汁、组织液等，由于没有完整的细胞结构，只能选择一些分泌蛋白作为内参。

7. 验证内参抗体质量：

（1）阳性对照实验：用已知表达的样本验证抗体有效性。

（2）梯度上样验证：内参条带强度应与上样量呈线性关系。

（3）多内参交叉验证：高分文章标配，比如同时跑β-Actin和 GAPDH。